13 abr, 2017
por Daniel Geraldes
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Segurança das Farinhas e Gorduras

Nos quatro artigos iniciais tratamos dos principais assuntos sobre segurança das farinhas e gorduras, onde foi demonstrado que esses produtos serão extremamente seguros se:

– existir controle rigoroso da barreira térmica e ter implantado um programa de BPF e/ou APPCC;

– a unidade de reciclagem animal for efetivamente dividida em duas áreas distintas: Área Úmida e Área Seca;

– não houver água disponível no sistema e nas farinhas após a barreira térmica;

– a correta monitoria microbiológica for implantada e;

– se métodos mitigatórios de controle de materiais estranhos forem adotados.

Nos dois artigos subsequentes, discorremos sobre a qualidade de gorduras.

No último, foi explicado o que é proteína e como os animais a absorvem. No presente artigo entenderemos como se avalia a digestibilidade da proteína em situações práticas, encerrando assim, a sequência planejada de oito artigos.

Avaliando a digestibilidade das proteínas animais

Conhecer a digestibilidade das matérias-primas é muito importante para todos os nutricionistas, seja para a fabricação de dietas de gado, aves, suínos, peixes ou animais de estimação. A digestibilidade verdadeira é muito difícil e dispendiosa para se medir, pois exige pesquisa em animais (“in vivo”).

Atalhos e métodos rápidos, em larga escala, de baixo custo, reproduzíveis e realizados em laboratório (“in vitro”) foram desenvolvidos para estimar a digestibilidade de vários alimentos, uma vez que os compradores querem pagar pelo valor real do produto. Já os produtores querem caracterizar corretamente seus produtos (Meeker, 2012) para melhorar seus métodos produtivos, atendendo as especificações de seus clientes.

Métodos “in vitro” acompanhados de sistemas enzimáticos devem apresentar características semelhantes àquelas do trato gastrintestinal (Boisen & Eggum, 1991). De maneira geral, esses métodos aferem a taxa inicial de hidrólise e determinam valores de digestibilidade dos alimentos, tentando predizer o resultado verificado “in vivo” (Kawauchi, et al., 2014).

O maior desafio das metodologias “in vitro” é conseguir reproduzir laboratorialmente o complexo mecanismo de digestão que acontece dentro do trato digestório dos animais. Muitos aspectos fisiológicos (por exemplo: resposta a estímulos químicos) são limitantes para obtenção de tal objetivo. Uma das consequências de tais limitações é que, de modo geral, grande parte dos resultados obtidos por meio de métodos de solubilidade “in vitro” são contraditórios (Swaisgood & Catignani, 1991).

Dentre os métodos enzimáticos, o da digestibilidade proteica em pepsina sobrenadante é o mais utilizado quando se deseja avaliar a qualidade da proteína das farinhas de origem animal, sendo que este é o único método “in vitro” reconhecido pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 1999). No Brasil a metodologia mais utilizada é a recomendada pelo Compêndio Brasileiro de Nutrição Animal (Sindirações, 2009), que em muito se assemelha ao do AOAC. Esse método “in vitro” é amplamente aceito pela indústria de alimentos por ser relativamente simples, de baixo custo, rápido e por possibilitar comparações entre grande número de amostras simultaneamente (Ravindran & Briden, 1999).

O princípio envolvido nesse método é a formação do complexo “chave-ferradura” (Sindirações, 2009), que se forma no momento que a enzima (pepsina) entra em contato com a amostra (farinha de origem animal). Vale-se da incubação do reagente (pepsina) e da amostra por 63 horas a 45oC seguido de medição do teor de proteína solubilizado. A digestibilidade é calculada pela diferença entre proteína solubilizada e proteína bruta da amostra. A concentração de pepsina é um dos fatores críticos na adoção deste método. Diversos trabalhos científicos foram realizados na intenção de se determinar a diluição de pepsina mais apropriada para a metodologia.

Entendendo os resultados experimentais: “in vivo” X “in vitro”

Ao se avaliar a qualidade de farinhas de penas em dietas de frangos de corte (Han & Parsons, 1991), concluiu-se que a redução da concentração de pepsina de 0,2% para 0,002% aumenta a correlação entre a digestibilidade “in vitro” (laboratorial) e a digestibilidade “in vivo” (galos cecotomizados). Analisando os dados do experimento (gráfico 1), observa-se que, numericamente, a digestibilidade a 0,2% apresenta resultados mais próximos à digestibilidade “in vivo”, e que há uma significativa queda no valor numérico da digestibilidade à 0,002%, apesar da maior correlação estatística com os dados “in vivo”. Chamamos atenção para as amostras destacadas: a amostra com pior digestibilidade “in vivo”, foi a 5a colocada “in vitro” (pepsina a 0,002%) entre 7 amostras, e a amostra com melhor digestibilidade “in vivo”, apresentou apenas o 3o maior valor “in vitro” (pepsina a 0,002%).

Nota-se claramente que, ao se adotar a maior diluição de pepsina, se distanciou numericamente dos valores médios de digestibilidade proteica “in vivo” (77,3%) para “in vitro” (75,8% e 32,2% para pepsina a 0,2% e 0,002% respectivamente). Isso representa uma “queda” de 45,1 pontos percentuais nos valores de digestibilidade “in vitro” com pepsina a 0,002% frente à digestibilidade “in vivo”, mostrando que apesar da digestibilidade “in vitro” a 0,002% apresentar uma maior correlação estatística com a digestibilidade “in vivo”, os resultados laboratoriais (numéricos) não refletem a realidade biológica.

Esses dados coincidem com os obtidos em outra pesquisa (Kawauchi, et al., 2014). Ao avaliarem a digestibilidade proteica “in vivo” e “in vitro” de farinhas de vísceras de aves em dietas de cães, observaram significativa queda nos valores absolutos médios, de 84,6% da digestibilidade “in vivo” para 79,4%, 67,5% e 52,4% quando realizado analise “in vitro” (pepsina diluída a 0,02%, 0,002% e 0,0002% respectivamente), conforme pode ser visto no gráfico 2. A diluição de pepsina com maior correlação estatística (e não numérica) com a digestibilidade “in vivo” foi a 0,02%.

É interessante notar (gráfico 2) que ao se aumentar a diluição da pepsina de 0,02% para 0,002% e para 0,0002%, as amostras destacadas (a 2o melhor e a pior digestibilidade “in vivo”) não apresentam diferenças significativas de resultado, chegando até a trocarem de posição quando a digestibilidade estava a 0,002%

Em outro experimento (Parsons, et al., 1997), dessa vez com farinha de carne e osso, os pesquisadores chegaram à conclusão que utilizar-se da análise “in vitro” com pepsina a 0,002% apresenta uma maior correlação estatística que outras diluições, porém, numericamente, ela diverge da digestibilidade proteica “in vivo” (digestibilidade verdadeira em galos), onde as médias foram: 85,9% “in vivo”, e 86,2%, 71,1% e 46,5% “in vitro” para pepsina diluída a 0,2%, 0,002% e 0,0002% respectivamente.

A análise “in vitro” com pepsina a 0,2% reduziu a variabilidade dos resultados, impossibilitando a classificação das amostras quanto à sua qualidade, porém, é essa a metodologia que apresenta resultados numéricos mais semelhantes aos observados “in vivo”.

Nesse experimento (gráfico 3), a farinha com pior digestibilidade “in vivo” (digestibilidade de 80%) entre 14 amostras, ficou com o 10o, 6o e 6o melhor resultado “in vitro” em pepsina a 0,2%, 0,002% e 0,0002% respectivamente. Duas farinhas apresentaram o melhor resultado “in vivo” (digestibilidade de 91%), sendo que elas se comportaram de maneira díspar nas análises “in vitro”, sendo que uma ficou com o 1o , 2o e 4o lugar e outra ficou com o 4o, 4o e 3o melhores resultados “in vitro” para pepsina a 0,2%, 0,002% e 0,0002%.

Interpretando os resultados “in vitro”

Toda essa variação pode ser parcialmente explicada pelo desvio analítico da metodologia “in vitro”. De acordo com o Compêndio Brasileiro de Nutrição Animal (Sindirações, 2009), o desvio analítico interlaboratorial da análise de pepsina a 0,2% obedece a fórmula “3299/X – 32”. Com a pepsina a 0,002%, o desvio segue a fórmula “1142/X – 2”. Portanto, espera-se que:

– Pepsina a 0,2%: entre 4,7% e 12,0% de desvio analítico esperado (entre 90% e 75% de digestibilidade “in vitro”, respectivamente);

– Pepsina a 0,002%: entre 14,3% e 55,1% de desvio analítico esperado (entre 70% e 25%, de digestibilidade “in vitro”, respectivamente).

O que isso significa? Peguemos como exemplo a amostra de farinha de penas com melhor resultado “in vivo” (vide gráfico 1). Digestibilidade “in vivo” da proteína de 80,4%, digestibilidade em pepsina a 0,2% de 77,3% e em pepsina a 0,002% de 40,3%. Ao aplicarmos a fórmula do desvio analítico, chegamos aos seguintes resultados:
– Pepsina a 0,2% = 77,3% ± 10,7% (resultados considerados equivalentes se entre 85,6% e 69,0%);

– Pepsina a 0,002% = 40,3% ± 26,3% (resultados considerados equivalentes se entre 50,9% e 29,7%).

Ou seja, quanto maior for a diluição, maior é o grau de incerteza do resultado obtido.

É válido ressaltar que nem todos os pesquisadores concordam que o caminho seria aumentar a diluição de pepsina. Estudando o efeito de desafio térmico em farinhas de peixe na alimentação de salmonídeos (peixes de água fria), os pesquisadores (March & Hickling, 1982) concluíram que a análise de digestibilidade deveria ser ajustada para as condições do animal. Ao invés de se reduzir a concentração de pepsina, obtiveram melhores resultados ao se reduzir a temperatura de incubação da amostra de 45oC para 20oC a uma concentração de 0,1% de pepsina. Concluíram também que concentrações de pepsina abaixo de 0,001% não apresentam utilidade prática em qualquer temperatura de incubação.

Apesar dessas limitações do método “in vitro” de digestibilidade de pepsina, ainda assim o nutricionista necessita conhecer qual farinha de origem animal apresenta maior ou menor digestibilidade. Um recente estudo trouxe um pouco mais de luz sobre o desafio. Ao analisar farinhas de carne e ossos de diversas origens em dietas de frangos de corte, os pesquisadores (Davis, et al., 2015) chegaram a diversas conclusões:

– não há vantagens em se reduzir a concentração de pepsina de 0,02% para 0,002%;

– numericamente, os resultados com pepsina diluída a 0,02% são superiores e mais próximos à digestibilidade “in vivo” que os obtidos a 0,002% de diluição;

– há uma correlação estatística entre pepsina a 0,02% e digestibilidade de aminoácidos quando todas as amostras são avaliadas;

– ao se retirar os 2 melhores e os 2 piores resultados de digestibilidade “in vivo”, não se observa correlação estatística entre a análise de pepsina (a qualquer concentração) e a digestibilidade “in vivo”;

– amostras com baixa digestibilidade “in vitro” (pepsina a 0,02% ou 0,002%) significa baixa digestibilidade “in vivo”;

– amostras com alta digestibilidade “in vitro” (pepsina a 0,02% ou 0,002%) indica uma tendência de maior digestibilidade “in vivo”;

– resultados medianos de digestibilidade “in vitro” (pepsina a 0,02% ou 0,002%) não se prestam para classificar amostras quanto à sua digestibilidade “in vivo” (Gráfico 4).

Variações no resultado entre 81% e 91% de digestibilidade “in vitro” (pepsina a 0,02%) não tiveram qualquer correlação com a digestibilidade “in vivo” dos aminoácidos, tampouco o aumento numérico da digestibilidade “in vitro” representou aumento da digestibilidade “in vivo” dos aminoácidos. Esse mesmo quadro de inexistência de correlação se repetiu com a pepsina a 0,002%.

Portanto, entendemos que:

– a metodologia de pepsina a 0,2% é a metodologia “in vitro” com resultado numérico mais semelhante ao valor da digestibilidade “in vivo”;

– ao adotar maiores diluições de pepsina (0,02% ou 0,002%) distancia-se o resultado da análise “in vitro” do valor numérico da digestibilidade “in vivo”, deixando de seguir o propósito de qualquer análise “in vitro”: simular as condições “in vivo”;

– que maiores diluições de pepsina implica em maior desvio analítico interlaboratorial, dificultando a comparação dos resultados obtidos em diferentes laboratórios;

– em um processo decisório, temos que ter consciência dessas divergências de resultados de digestibilidade ao aumentarmos as diluições da pepsina (de 0,2% para 0,02% ou 0,002%) nas análises “in vitro”.

Conclusões

O teste “in vitro” de digestibilidade em pepsina tem um propósito útil e seu lugar na indústria. Ocorre que esse teste é usado de maneira mais ampla, para tomada de decisões de mais longo alcance, ao que ele verdadeiramente se destina. Muitas pessoas entendem os resultados desse teste como “preto no branco”, confiáveis e sem complicações. Na realidade, o teste “in vitro” de digestibilidade em pepsina é uma aproximação, um indicador correlacionado ao verdadeiro estado das coisas, mas não um quadro completo, tampouco claro ou definido (Meeker, 2012).

Portanto, o teste de digestibilidade pepsina para farinhas de origem animal é mais assertivo quando houver a presença de lotes de má qualidade. Entendemos que esse teste não deva ser usado para classificar as amostras de farinhas com resultados medianos, tampouco ser considerado em matrizes de ingredientes de formulação de menor custo, ou para estimar valores de oportunidade em fórmulas de preços mínimos, pois as limitações intrínsecas a esse método fatalmente resultarão em erros.

Bibliografia Citada

AOAC, 1999. Official method 971.09. Em: Official Methods of Analysis of AOAC International. 16a ed. Gaithersburg(MD): AOAC.

Boisen, S. & Eggum, B. O., 1991. Critical Evaluation of in Vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals. Nutrition Research Reviews, Volume 4, pp. 141-162.

Davis, T. M., Parsons, C. M., Utterback, P. L. & Kirstein, D., 2015. Evaluation of the pepsin digestibility assay for predicting amino acid digestibility of meat and bone meals. Poultry Science, Issue 94, pp. 1003-1008.

Han, Y. & Parsons, C. M., 1991. Protein and Amino Acid Quality of Feather Meals. Poultry Science, Issue 70, pp. 812-822.

Kawauchi, I. M. et al., 2014. Prediction of crude protein digestibility of animal by-product meals for dogs by the protein solubility in pepsin method. J. of Nutrition Science, 3(36), p. 1 a 5.

March, B. E. & Hickling, D. R., 1982. Assessment of heat damage to protein digestibility from fish meals by in vitro pepsin solubilization at different temperatures. Canadian Journal of Animal Science, 62(2), pp. 657-660.

Meeker, D., 2012. Digestibility Dilemma. Render Magazine, Junho, p. 28.

Parsons, C. M., Castanon, F. & Han, Y., 1997. Protein and Amino Acid Quality of Meat and Bone Meal. Poultry Science, Issue 76, pp. 361-368.

Ravindran, V. & Briden, W. L., 1999. Amino acid availability in poultry – in vitro and in vivo measurements. Australian Journal on Agricultural Research, Volume 50, pp. 889-908.

Sindirações, 2009. Desvios Analíticos. Em: Compêndio Brasileiro de Nutrição Animal. s.l.:s.n., pp. 363-365.

Sindirações, 2009. Digestibilidade Proteína em Pepsina no Sobrenadante. Médodo 46.. Em: Compêndio Brasileiro de Nutrição Animal. s.l.:s.n., pp. 171-175.

Swaisgood, H. E. & Catignani, G. L., 1991. Protein Digestibility: “In vitro” methods of assessment. Em: Advances in Food and Nutrition Research. Califórnia: U.C. Davis, pp. 185-237.


PUBLICAÇÃO EXCLUSIVA DA REVISTA GRAXARIA – EDIÇÃO JANEIRO/FEVEREIRO DE 2017.

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